Micro modulare

Microsistemi e nanoingegneria volume 8, numero articolo: 82 (2022) Citare questo articolo

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Un contenimento efficace della pandemia di COVID-19 richiede il rilevamento rapido e accurato dell’agente patogeno. La reazione a catena della polimerasi (PCR) rimane il gold standard per la conferma del COVID-19. In questo articolo, riportiamo le prestazioni di una piattaforma modulare economicamente vantaggiosa di trascrizione inversa microfluidica (RT)-PCR e di amplificazione isotermica mediata da RT-loop (RT-LAMP), Epidax®, per i test point-of-care e la conferma di SARS-CoV-2. Questa piattaforma è versatile e può essere riconfigurata per lo screening utilizzando test RT-PCR o RT-LAMP endpoint o per test di conferma utilizzando RT-PCR in tempo reale. Epidax® è altamente sensibile e rileva solo 1 copia di RNA per µL per la RT-PCR in tempo reale e endpoint, utilizzando solo la metà dei reagenti. Abbiamo ottenuto risultati comparabili con quelli di una piattaforma commerciale rilevando virus SARS-CoV-2 da 81 estratti clinici di RNA. Epidax® può anche rilevare SARS-CoV-2 da 44 campioni nasofaringei senza estrazione dell'RNA utilizzando un test RT-PCR diretto, che riduce il tempo dal campione alla risposta a un'ora con passaggi minimi da parte dell'utente. Inoltre, abbiamo convalidato la tecnologia utilizzando un test RT-LAMP su 54 estratti clinici di RNA. Nel complesso, la nostra piattaforma fornisce una soluzione diagnostica sensibile, economica e accurata per ambienti con risorse limitate.

Dalla sua comparsa nel dicembre 2019, la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) si è diffusa in tutto il mondo, causando morti, malattie e interruzioni della vita e delle attività economiche.

Un controllo efficace della pandemia di COVID-19 richiede un rilevamento rapido e accurato del virus. La pubblicazione iniziale del genoma SARS-CoV-2 nel gennaio 2020 ha consentito ad aziende e laboratori di tutto il mondo di sviluppare vari test e tecniche per la diagnosi di COVID-191,2,3. La reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa in tempo reale (RT–PCR) rimane il gold standard per l’identificazione di SARS-CoV-2. Poiché un programma di test completo richiederebbe probabilmente uno screening ampiamente accessibile e rapido in combinazione con test di conferma PCR altamente sensibili, vi è la necessità di metodi alternativi per identificare gli individui infetti che siano sufficientemente economici, portatili ed efficaci da consentire una diagnosi rapida sul momento d'uso. Questi test point-of-care (POC) sono uno strumento importante da implementare alle frontiere per aprire i viaggi e le economie internazionali.

Vari test commerciali di laboratorio e POC sono stati implementati a livello globale: Cepheid® Xpert® Xpress SARS-CoV-24, cobas® SARS-CoV-25 di Roche, GenMark ePlex® SARS-CoV-26, test COVIDNudge di DnaNudge7,8, Abbott ID Ora COVID-199 e altri10. I primi tre sono sistemi completamente automatizzati per l'analisi di campioni multipli con elevata sensibilità; ad esempio, è stato riferito che Xpert® Xpress ha raggiunto una sensibilità del 98,3% nel loro test PCR di 46 minuti11. Tuttavia, l’apparecchiatura è costosa e ha un ingombro elevato, il che limita l’espansione dei test e l’utilizzo in contesti con risorse limitate. COVIDNudge è una piattaforma RT-PCR senza laboratorio in grado di rilevare sette target virali (RdRp1, RdRp2, gene E, gene N, N1, N2 e N3) e un controllo (ribonucleasi P), con una sensibilità del 94% in un Prova di 90 minuti8. Tuttavia, il numero eccessivo di pozzetti richiesti per un campione (72 pozzetti) aumenta la complessità operativa e rende il test soggetto a errori di gestione e interpretazione. I test POC approvati dalla FDA che utilizzano l'amplificazione isotermica, come Abbott ID Now COVID-19, possono rilevare campioni positivi in ​​soli 5 minuti e risultati negativi in ​​13 minuti utilizzando un piccolo dispositivo portatile12. Sebbene questo approccio possa ottenere risultati rapidi, sono stati segnalati casi di accuratezza e sensibilità limitate del test11,13.

L'uso della microfluidica per test diagnostici, in particolare in un contesto POC, è vantaggioso perché consente di eseguire test utilizzando una quantità minima di campione, consentendo potenzialmente un rilevamento e un'implementazione più rapidi con meno reagenti14. Ci sono stati numerosi sviluppi nei sistemi PCR microfluidici15. Alcuni progetti forniscono più funzioni su chip per la preparazione e il rilevamento dei campioni. Tuttavia, questi sistemi non sono modulari e presentano ancora sfide da superare per l’implementazione sul campo. La maggior parte dei chip PCR sono realizzati in vetro, PDMS o plastica, che hanno una bassa conduttività termica e non sono adatti per applicazioni che richiedono un controllo rapido e preciso della temperatura all'interno del canale microfluidico16. Per superare questa limitazione, i reagenti potrebbero essere spostati in regioni del chip preriscaldate alla temperatura desiderata per la PCR. Ciò è stato ottenuto utilizzando un sistema a flusso continuo con più zone preriscaldate17,18 o facendo circolare i reagenti tra zone preriscaldate16. Tuttavia, questi metodi richiedono pompe a siringa programmabili ad alta precisione che rendono il sistema ingombrante e inadatto alle impostazioni POC. Inoltre, il riscaldamento multizona aumenta la complessità dei chip, il che rappresenta una sfida per la produzione di massa. Questo problema è amplificato se su un chip sono necessarie più camere di reazione (ad esempio, per ospitare controlli negativi, positivi e interni). La microfluidica consente inoltre l'uso di volumi minuti, riducendo così il volume dei reagenti necessari. Ciò è particolarmente importante in una pandemia che interrompe la catena di approvvigionamento dei reagenti per i test. È stato dimostrato che un lab-on-chip microfluidico è in grado di eseguire la PCR su campioni con volumi nell'ordine dei nanolitri, fino a 30 nL19,20. Sebbene un volume piccolo possa ridurre l'utilizzo del reagente, un volume troppo basso potrebbe influenzare negativamente la sensibilità del test. Ciò è più pronunciato quando si tenta di rilevare casi asintomatici in cui il campione di input ha un titolo virale molto basso. Questi chip della gamma nanolitri non possono essere scalati fino ai microlitri a causa della progettazione del loro sistema. Oltre alla PCR, sono stati utilizzati sistemi portatili lab-on-chip per eseguire l'amplificazione isotermica mediata dal circuito di trascrizione inversa (RT-LAMP) per test diagnostici21,22,23,24,25,26. Questi sistemi non possono eseguire la PCR a causa delle loro unità di controllo termico semplificate. La maggior parte non è in grado di misurare la dinamica della reazione e di catturare solo i risultati finali. Inoltre, RT-LAMP ha una sensibilità inferiore rispetto a RT-PCR per il rilevamento di COVID-191,11,27,28.