Valutazione di metodi di estrazione per studi metabolomici non mirati per future applicazioni in modelli di infezione da larve di pesce zebra

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 7489 (2023) Citare questo articolo

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La preparazione dei campioni nella metabolomica non mirata dovrebbe consentire estrazioni riproducibili del maggior numero possibile di molecole. Pertanto, ottimizzare la preparazione del campione è fondamentale. Questo studio ha confrontato sei diverse procedure di estrazione per trovare quella più adatta all'estrazione delle larve di pesce zebra nel contesto di un modello di infezione. Sono state testate due estrazioni monofase che utilizzano metanolo (I) e una singola fase miscibile di metanolo/acetonitrile/acqua (II) e due metodi a due fasi che utilizzano la separazione di fase tra cloroformio e combinazioni metanolo/acqua (III e IV). Per i metodi III e IV (III_B e IV_B) è stata utilizzata un'ulteriore omogeneizzazione delle sfere. Per la valutazione del metodo sono stati utilizzati nove standard interni e 59 molecole di interesse (MoInt) correlate all'infezione da micobatteri. I metodi a due fasi (III e IV) hanno portato a un conteggio di caratteristiche inferiore, aree di picco di MoInt più elevate, in particolare amminoacidi, e coefficienti di variazione più elevati rispetto alle estrazioni in una fase. L'aggiunta dell'omogeneizzazione delle sfere ha aumentato il conteggio delle caratteristiche, le aree dei picchi e i CV. L'estrazione I ha mostrato aree di picco più elevate e CV inferiori rispetto all'estrazione II, essendo quindi il metodo monofase più adatto. L'estrazione III e IV hanno mostrato risultati simili, con la III più facile da eseguire e meno soggetta a imprecisioni. Pertanto, per future applicazioni nella metabolomica delle larve di pesce zebra e nei modelli di infezione, si potrebbero scegliere le estrazioni I e III.

La metabolomica mira a profilare analiticamente i cambiamenti delle molecole < 1500 Da (metaboloma) presenti in un organismo o in un sistema modello in un determinato momento1,2. Il metaboloma comprende metaboliti endogeni e metaboliti provenienti da fonti esogene come i farmaci. Mentre gli approcci mirati si basano sulla quantificazione di metaboliti selezionati, spesso appartenenti a un particolare gruppo di metaboliti, la metabolomica non mirata mira a rilevare il maggior numero possibile di metaboliti1,2,3. Le tecniche analitiche spesso applicate per la separazione del campione includono la cromatografia liquida (LC) e la gascromatografia, entrambe regolarmente accoppiate con la spettrometria di massa1,2,3. La separazione LC negli approcci non mirati viene spesso eseguita utilizzando colonne a fase inversa per la separazione di metaboliti non polari, colonne a fase normale per la separazione di metaboliti polari o colonne per cromatografia liquida a interazione idrofila (HILIC) come variazioni delle colonne a fase normale, impiegando uno strato d'acqua sopra la loro fase stazionaria, risultando in una separazione basata principalmente sulla partizione liquido-liquido. Le colonne fenil-esile sono colonne a fase inversa con selettività unica per le molecole aromatiche. Dopo la separazione, i metaboliti vengono ionizzati, comunemente utilizzando la ionizzazione elettrospray (ESI) o la ionizzazione a pressione atmosferica, e analizzati utilizzando un analizzatore di massa, spesso Orbitrap o strumenti a tempo di volo1,2. Gli spettri di frammentazione possono essere generati nella stessa analisi utilizzando ad esempio l'acquisizione dipendente o indipendente dai dati, o in un'analisi successiva. I dati così generati possono quindi essere ulteriormente elaborati utilizzando metodi bioinformatici come il rilevamento dei picchi e la preelaborazione, seguiti da statistiche multivariate per la valutazione e il confronto degli spettri di frammentazione con le librerie di riferimento per l'identificazione1,2,3,4,5.

Per comprendere l'effetto delle malattie, ad esempio la tubercolosi6, e per trovare biomarcatori per una diagnosi o un trattamento efficace, viene spesso applicata la metabolomica e si osserva il cambiamento del metaboloma dell'ospite. Nello specifico, le modifiche al metaboloma endogeno originate dall'infezione da Mycobacterium tuberculosis sono state ampiamente studiate negli esseri umani4,5,6,7 e in modelli animali8 tra cui topi, porcellini d'India, conigli e primati non umani9. I cambiamenti indotti sul metaboloma sono stati studiati anche utilizzando il micobatterio non tubercolare M. marinum nelle larve di pesce zebra (Danio rerio, ZF) come uno dei suoi ospiti naturali10. Tale modello ZF che utilizza M. marinum assomiglia alle strutture simili al granuloma, tipicamente presenti nella sua controparte dei mammiferi11,12,13,14. Il genoma ZF è identico per circa il 70% a quello umano15 e in diversi studi è stato riportato un metabolismo simile a quello umano, sia per quanto riguarda il metabolismo xenobiotico16,17,18,19, sia per quanto riguarda il metaboloma dell'ospite in caso di infezione20,21. Il modello delle larve ZF presenta ulteriori vantaggi, che includono la facilità di manipolazione, la trasparenza ottica di embrioni e larve e costi monetari inferiori rispetto ad altri organismi22,23. Inoltre, gli esperimenti eseguiti con embrioni e larve di età inferiore a 120 ore dopo la fecondazione (hpf) non sono considerati esperimenti sugli animali all'interno dell'Unione Europea (direttiva UE, 2010/63/UE)24. A causa della moltitudine di vantaggi, gli studi ZF che utilizzano la metabolomica non mirata sono oggigiorno sempre più comuni25,26, ma raramente utilizzati nel contesto delle malattie e in particolare del M. marinum20.